Hemmung alkalischer phosphatase phosphat
ich habe die hemmende Wirkung von Phosphat auf die Alkalische Phosphatase untersucht und bin dabei auf ein Ergebnis gekommen, dass ich mir nicth erklären kann:
Ohne Inhibitor: vmax = 0,73 KM = 0,18
Mit Inhibitor: vmax = 1,16 KM = 1,31
Kann mir das irgendjemand erklären? War die Hemmstofflösung nicht mehr "gut"? Ich bin mir absolut sicher, dass ich alle Ansätze absolut korrekt pipettiert habe!
Ich bin mit meinem Latein am Ende, hoffe ihr könnt mir weiterhelfen.
PS.: Bestimmung von km und vmax erfolgte grafisch über lineweaver burk
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Hemmung von alkalischer Phosphatase durch Phosphat
Wenn die Ergebnisse interpretiert werden als:
Ohne Inhibitor wird v_max bei einer Substratkonzentration von 0,73 x K_m erreicht und mit bei 1,16 x K_m, dann ist die Welt doch in Ordnung. Bei Vorliegen des kompetetiven Inhibitors Phosphat braucht es mehr Substrat, um Substratsättigung zu erzielen.
Hallo, da liegt wohl ein Missverständnis vor:
Vmax its immer in der Einheit mikromol/liter mal sekunde angegeben, und der Wert von Km in mmol/liter.
Ich hoffe damit konnte ich das klären, aber für deine Hilfe.
Das ist mir schon klar, dass K_m eine Konzentrationsgröße ist, nämlich sie entspricht derjenigen Substratkonzentration, bei die die Reaktionsgeschwindigkeit halbmaximal ist. Ob man das nun in mol/L, mmol/L oder μmol/L angibt, ist ja eine reine Geschmacksfrage, da man nur das Komma verschiebt. Und Einheiten wegzulassen ist nie eine gute Idee! Was ich meine ist, es kann nicht K_m ein Vielfaches oder ein Bruchteil von v_max sein, da, wie Du selber schreibst, diese unterschiedliche Einheiten haben. Die Einheit für die Reaktionsgeschwindigkeit ist dann μmol/, also Mikromol pro
Die Ergebnisse sind alleine von den Einheiten her nicht plausibel. K_m, die Michaelis-Menten-Konstante, hat die Einheit einer Konzentration und v_max hat die Einheit einer zeitlichen Konzentrationsänderung, also. Von daher ist das Ergebnis "vmax = 0,73 KM = 0,18" nicht brauchbar.
Um helfen zu können, braucht es etwas mehr Information zum Versuchsablauf und die zugehörigen Daten zu Konzentrationen an Substrat, Inhibitor und zeitlichen Umsatz.
Hallo Picus48, leider liegt hier ein missverständnis vor, vmax und KM sind getrennt voneinander zu betrachten, die Einheiten habe ich weggelassen, da ich dachte das wäre klar.
Tut mir leid, ich hoffe ich konnte dir das etwas klarer machen.
P.S.: Zum Versuchsablauf: nach Zugabe des Enzyms wurde die Reaktion im Photometer für ca. 60 sekunden beobachtet (-> Photometer) und dann Anfangs und Endabsorption notiert. Daraus der mittelwert gebildet und V0 ausgerechnet. Mit vo-Werten wurde dann die Lineweaver-Burk Auftragung erstellt und grafisch vmax und km bestimmt.
Destrover555
Zum PS. Ja, das ist die übliche Vorgehensweise. Nach Lineweaver-Burk erhält man dann im Idealfall eine Gerade, mit den Achsenabschnitten 1/K_m und 1/v_max. Bei Zugabe eines kompetitiven Inhibitors muss die erhaltene Gerade eine größere Steigung haben und der Schnittpunk mit der 1/v-Achse gleich bleiben.
Absolut korrekt, das ist der Idealfall, allerdings liegt mein Vmax wie oben beschrieben mit Inhibitor höher als ohne Inhibitor, und das kann ich mir nicht erklären.
Dann hilft nur noch das Experiment neu aufzusetzen. Alle Lösungen neu ansetzen und bei zunächst einer Substratkonzentration mit und ohne Inhibitorzusatz messen. Nur wenn v_o mit Inhibitorzusatz kleiner ist als ohne, macht es Sinn, den Lineweaver-Burk-Plot erneut zu erstellen.
Zur Klärung des Problems: Der VErsuch läuft nicht in dem Sinne falsch, vielmehr sind die empirischen Parameter des Versuchs Km und Vmax in Realtion zueinande rzu sehen, so erkennt man: Vmax steigt nur um 50 % an, während KM um mehr als 700 % ansteigt. Somit ist das eindeutig und ohne jeden zweifel eine kompetitive Hemmung.
Destrover555